L'ESSENTIEL SUR L'ÉTUDE

Vous allez découvrir l’essentiel de l’étude conduite de 2006 à 2009 par le CIV en collaboration avec l’INRA pour actualiser les données sur les valeurs nutritionnelles des viandes de boucherie^*.

Cette étude a pour but de répondre à la demande croissante d’informations nutritionnelles sur les viandes émanant des consommateurs, des praticiens de la santé, des différents professionnels des filières de production et de transformation.

Le protocole a été construit en concertation avec l’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA). Un soin particulier a été porté à la méthodologie avec une maîtrise de l’élevage des animaux et des choix représentatifs des systèmes de production français, une large gamme de morceaux et une sélection de laboratoires de référence.

L’étude est centrée sur les nutriments pour lesquels la viande contribue significativement à la couverture des besoins nutritionnels. Les résultats ont été analysés avec précision pour s’assurer de la cohérence d’ensemble des données. Ils ont également été transmis à l’AFSSA en vue d’enrichir la table de composition du Ciqual.

Nous espérons que ce site constituera pour vous un outil utile et pratique.

Bonne navigation.

Gilles Gandemer
Directeur de recherches - Institut National de la Recherche Agronomique.

^* Pour connaître les valeurs nutritionnelles du porc : INAPORC www.leporc.com

Différents acteurs ont collaboré avec le Centre d’Information des Viandes (CIV) à la conception et à la mise en place de cette étude.

• Pilotage de l’ensemble de l’étude et de l’exploitation des résultats : le Centre d’Information des Viandes (CIV).
• Etude préalable à l’élaboration du protocole : l’Institut de l’Elevage et le CIV.
• Groupe de travail sur la conception du protocole :
  • L’Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA ; équipe en charge de la table de composition du Ciqual).
  • Les représentants de différentes organisations professionnelles adhérentes à INTERBEV. (Association Nationale Interprofessionnelle du Bétail et des Viandes).
  • L’Institut National de la Recherche Agronomique (INRA).
  • Le CIV.
• Mise en place et réalisation :
  • Coordination scientifique : l’Unité de Recherche sur les Herbivores de l’INRA de Theix, Equipe Nutriments et Métabolismes (URH-NEM INRA - 63 122 - Saint-Genes-Champanelle)
  • Réalisation des analyses : l’INRA Theix (Unité de Nutrition Humaine (UNH) et Unité de Recherche sur les Herbivores (URH)) ; l’ADIV (Association pour le développement de l’Institut de la Viande) ; l’Aérial ; le Département de Biologie Intégrée du CHU Grenoble.

Pour disposer d’un ensemble de données cohérentes, le protocole a été construit de façon à maîtriser la totalité des étapes, du choix des animaux jusqu’aux traitements des données.
Les analyses ont été réalisées sur les viandes crues pour évaluer la variabilité de leur composition en s’affranchissant de celle induite par la grande diversité des pratiques culinaires.
Les viandes commercialisées varient notamment selon les morceaux et les facteurs d’élevage.
L’étude s’est donc attachée à couvrir cette variabilité par des choix raisonnés au niveau de l’échantillonnage des animaux, du choix des morceaux analysés, des nutriments dosés et des méthodes d’analyse.

Les animaux et leur mode d’élevage ont été choisis pour obtenir un échantillon représentatif des viandes consommées en France :

• Bœuf : 8 animaux de race laitière et 8 de race à viande,
• Veau : 16 animaux de race laitière,
• Viande chevaline : 8 chevaux de réforme,
• Agneau : 8 agneaux élevés en bergerie.

Tous ces animaux ont été élevés en stations expérimentales et ont reçu une alimentation conforme aux pratiques les plus courantes en France. Ils ont fait l’objet d’un suivi tout au long de la période d’élevage.

Bœuf :

Choix des animaux
L’étude porte sur 8 vaches de réforme de race à viande (Charolaise) et 8 vaches de réforme de race laitière (Prim’holstein). Ce choix permet de couvrir la majorité des viandes du marché français. Devant l’impossibilité matérielle de couvrir toute la gamme des états d’engraissement des animaux, il a été décidé de se focaliser sur un échantillon d’animaux homogènes et représentatifs de leur catégorie. Les vaches ont donc été choisies dans la classe R de la grille EUROPA ce qui correspond à une note moyenne d’état corporel de 3. Les animaux abattus dans cette classe représentent au moins 80 % des Charolaises et plus de 60 % des Prim’holstein abattues en France (référence INTERBEV).

Elevage des animaux
Les animaux ont été élevés dans les stations expérimentales de l’INRA à Theix pour les Prim’holstein et à Bourges pour les Charolaises. Les animaux ont été choisis parmi des animaux ayant eu un mode de conduite et une alimentation classique pour ces types d’animaux. Ces vaches ont été alimentées pendant 7 semaines avec un régime classique de finition à base d'ensilage de maïs (à volonté) complété par 1,8 kg de tourteau de soja, 50 g d'urée, 150 g de mélange minéral et vitaminique.

Abattage des animaux
Les animaux ont été abattus à l’abattoir agréé CEE de l’INRA de Theix dans les conditions classiques d’abattage des bovins.
Le jour de l’abattage, les mesures classiques ont été réalisées pour connaître notamment le poids vif vide, le poids de dépôts adipeux du 5ème quartier, le poids des os canons avant et arrière. Le lendemain, la découpe et la dissection de la 6ème côte dorsale ainsi que les mesures de compacité de la cuisse sont réalisées pour permettre l’estimation du poids de gras, de muscle et de squelette de la carcasse à l’aide de la formule de Robelin et Geay (1976). Le pH du muscle Long dorsal est contrôlé pour détecter les possibles anomalies de maturation.

Agneau

Choix des animaux
L’étude porte sur 16 agneaux de race INRA 401. Cette race qui résulte du croisement Berrichon du Cher x Romanov est une race prolifique (2 agneaux/brebis) à vocation bouchère.

Elevage des animaux
Les animaux ont été élevés à la station «Intrabois» de l’INRA (Theix-63). Les animaux ont été divisés en deux lots de 8 agneaux. Un lot a été élevé en bergerie pendant 97 jours avec une ration composée de foin et de concentré. Le deuxième lot de 8 animaux a été élevé exclusivement au pâturage (prairie naturelle) pendant 110 jours. Plus de 80 % des agneaux produits en France le sont en bergerie. Le système d’élevage à l’herbe très minoritaire (quelques % de la production française) est un élevage à forte image qui méritait d’être pris en compte.

Abattage des animaux
Les animaux ont été abattus à l’abattoir agréé CEE de l’INRA de Theix, dans les conditions classiques d’abattage des ovins. Le poids vif moyen des animaux des deux lots était de 35 kg pour un poids moyen de carcasse de 16 kg. La note d’état d’engraissement des animaux était 2,6 ce qui correspond à un état d’engraissement moyen.

Veau

Choix des animaux
L’étude porte sur 16 veaux issus de vaches de race Prim’holstein, veaux de race laitière les plus largement utilisés dans ce type de production.

Elevage des animaux
Tous les animaux ont été élevés en station expérimentale (Institut de l’Elevage et Station expérimentale de la SERVAL). Ils sont élevés en loges de 3 à 5 animaux. Ils sont nourris avec un aliment lacté à base de poudre de lait dégraissé complété de protéines d’origine végétale et de matières grasses végétales et animales. Un kg d’extrait sec de l’aliment contient environ 650 g de poudre de lait, 150 g de protéines végétales et 180-200 g de matières grasses. Les animaux ont un accès libre à un aliment fibreux (crocfibre, eurofibre). Ce mode d’élevage couvre plus de 80 % de la production de viande de veau en France.
Les animaux ont été divisés en deux lots sur la base de la nature de la matière grasse de l’aliment lacté. En effet, selon les fabricants d’aliments, la matière grasse de l’aliment lacté est à dominante végétale ou animale. Après enquête auprès des fabricants, 1/3 des veaux sont nourris avec l’aliment à dominante « matières grasses végétales » et 2/3 avec celui à dominante « matières grasses animales ».
La matière grasse du premier lot « dit végétal » était composée de 80 g de graisses animales (saindoux) et de 120 g de graisses végétales (40 g de coprah et 80 g huiles de palme et de soja partiellement hydrogénées dans des proportions 2 pour 1). La matière grasse du deuxième lot était composée de 130 g de graisses animales (suif-saindoux 2/1) et de graisses végétales (60-70 g de coprah).
Les animaux du 1er lot ont consommé en moyenne 330 kg d’aliments lactés et 38 kg d’aliments fibreux.

Abattage des animaux
Les animaux ont été abattus à l’abattoir agréé de la société TENDRIADE à Chateaubourg (35), dans les conditions classiques d’abattage des veaux. Le poids vif moyen des animaux des deux lots était de 140 kg pour des veaux âgés de 5.5 mois. La note d’état d’engraissement des animaux était 2,6 ce qui correspond à un état d’engraissement moyen.

Viande chevaline

Choix des animaux
L’étude porte sur 8 chevaux de selle français de réforme (5 femelles et 3 hongres) et 8 poulains de race bretonne. Ce choix permet de couvrir la majorité des viandes chevalines du marché français.

Elevage des animaux
Pour assurer une bonne maîtrise des conditions d’élevage, les animaux ont été amenés à la station des haras nationaux de Chamberet. Huit chevaux de selle français âgés en moyenne de 16 ans (5 femmes, 3 mâles) ont été engraissés pendant 3-4 mois. Huit poulains de race bretonne sevrés et âgés de 7-8 mois ont été engraissés pendant 5 mois. Ils étaient alimentés avec du foin à 96 % de matières sèches (0,56 UFC et 4 % matières azotées par kg MS) et du concentré. L’aliment concentré était composé de céréales (74 % d’orge, 15 % d’avoine), de tourteau de soja (8 %) et de complément minéral et vitaminique (3 %). La consommation moyenne de foin a été de 10,6 et 8,3 kg de MS/j pour les chevaux de réforme et les poulains respectivement. Celle de concentré était de 2,0 et 3,6 kg de MS/j. Au terme de la période d’élevage, les chevaux de réforme étaient âgés de 16 ans et pesaient 608 kg en moyenne. Les poulains étaient âgés de 14 mois et 528 kg en moyenne. L’essentiel de la viande chevaline consommée en France provient de chevaux de réforme. L’élevage de jeunes chevaux de boucherie correspond à un système de production que la filière souhaite mettre en place.

Abattage des animaux
Les chevaux ont été abattus dans des abattoirs agréés proches de la station de Chamberet (Bessinne Gartempe pour les animaux de réforme, Ussel pour les poulains). Leur état d’engraissement était de 3,3 en moyenne pour les 2 lots. Le rendement d’abattage était respectivement de 59,5 et 56,3 % pour les chevaux de réforme et les poulains de trait. Une demi-carcasse de chaque animal a été acheminée à l’abattoir de l’INRA de Theix pour que les échantillons soient prélevés.

Trente morceaux ont été choisis sur différents critères (muscles oxydatifs ou glycolytiques, gros ou petits, morceaux à cuisson longue ou rapide, avec ou sans gras visible, avec ou sans os) pour couvrir au mieux la diversité des compositions nutritionnelles et des habitudes de consommation en France.
Les morceaux composés de muscles, de gras, de tissus conjonctifs (ou aponévroses) et d’os tels que l’entrecôte ou les côtes ont fait l’objet d’une procédure spécifique qui a consisté à analyser séparément la partie musculaire et l’ensemble gras-tissus conjonctifs.
Cela a permis de disposer des compositions nutritionnelles du muscle proprement dit (c’est-à-dire de la viande seule) et de celles de l’ensemble du morceau pour tenir compte de la diversité des pratiques des consommateurs et leur fournir une information adaptée.
Liste des morceaux étudiés:

• Bœuf :
  • Tende de tranche, faux-filet, bavette, macreuse (à bifteck), paleron
  • Entrecôte, plat de côte (morceaux hétérogènes)
  • Steak haché à 5 % de MG et steak haché à 15 % de MG
  • Joue, hampe, langue, cœur, foie, rognons (produits tripiers)
• Agneau :
  • Gigot, collier
  • Selle, côte filet, côte première (morceaux hétérogènes)
  • Foie (produits tripiers)
• Veau
  • Noix, jarret, épaule, collier, côte découverte
  • Foie (produits tripiers)
• Viande chevaline
  • Tende de tranche, faux-filet, entrecôte

Prélèvements des morceaux de viande et de produits tripiers
Les morceaux de viande sont disséqués de la carcasse 24 h post mortem avant d’être ensachés sous vide et maturés pendant 6 jours à + 4°C. Les foies de bœuf, de veau ou d’agneau ainsi que la langue, les rognons et le cœur pour le bœuf, sont prélevés le jour de l'abattage, puis conservés 24 h à + 4°C avant d’être découpés. Après découpe les différents morceaux sont surgelés à - 25°C avant d’être conservés à - 18°C.

Prélèvement des échantillons
Chacune des pièces de découpe est parée par le boucher. Les échantillons se présentent sous une forme aussi proche que possible des pratiques commerciales (morceaux parés, portions de 100-150 g).
5 à 6 tranches sont choisies au centre du morceau pour assurer une bonne représentativité de l’échantillon. Le prélèvement effectué sur chaque pièce de découpe est de 300-400 g, soit le double de la quantité nécessaire à la réalisation de l’ensemble des analyses. Une moitié des échantillons (2 tranches) est conservée à - 20°C pour parer à toute éventualité (échantillon de secours). L’autre moitié est dirigée vers le laboratoire de l’ADIV pour y être broyée de façon homogène et pour être répartie en parties aliquotes correspondant aux besoins de chaque laboratoire en charge des différentes analyses.
Les morceaux homogènes de viande (morceaux composés d’un seul muscle ou d’un ensemble homogène de muscles) et les produits tripiers parés sont acheminés directement à l’ADIV. Les morceaux hétérogènes font l’objet d’une séparation au couteau des parties muscle, gras-aponévroses et os. Chacun de ces compartiments tissulaires sont pesés. Les os sont jetés, la viande et le gras (+ aponévroses) sont ensachés séparément et acheminés à l’ADIV pour y être broyés. Chacun de ces deux compartiments est ensuite analysé séparément pour pouvoir fournir une information nutritionnelle aussi proche des habitudes du consommateur que possible. Ce procédé permet de disposer la composition du morceau complet (gras + muscle) ainsi que celle de la partie viande (muscle) uniquement pour ceux qui élimine le gras dans l’assiette.
Les échantillons sont maintenus congelés dans la carboglace pendant leur acheminement aux différents laboratoires.

Echantillonnage des steaks hachés :
48 steaks de viande hachée réfrigérée, répartis en deux lots de 5 et 15 % de matières grasses, ont été fournis par la société Charal ; chaque lot étant composé de 24 steaks issus de 6 mélées différentes, soient 4 steaks de 125 g par mélée composant l'échantillon à analyser.
L'échantillon a été ensuite traité comme les autres morceaux de viande.

Choix des nutriments
Seuls les nutriments pour lesquels la viande représente un apport significatif ont été analysés :

• protéines et composition en acides aminés,
• lipides et composition en acides gras,
• fer total, fer héminique, zinc, sélénium,
• vitamines B3, B6, B12 pour tous les morceaux et vitamine A pour le foie.

Pour prendre en compte les avancées récentes des connaissances sur les impacts santé des acides gras (comme en témoigne le récent Avis de l’AFSSA relatif à l’actualisation des apports nutritionnels conseillés pour les acides gras de mars 2010) et répondre à la demande croissante d’informations sur ces composés, l’étude a donné lieu à une analyse approfondie de la composition en acides gras des viandes.

Réalisation des analyses :
La coordination du protocole a été confiée à l’Unité de Recherche sur les Herbivores de l’INRA (63 122 - Saint-Genes-Champanelle).
Les analyses ont été réparties entre des laboratoires sélectionnés sur leur expertise dans le dosage du nutriment concerné au sein des produits carnés.

Les différentes analyses ont été réalisées par cinq laboratoires :

Méthodes d’analyse :

Homogénéisation des échantillons

Environ 150 g de muscle, de gras ou d’abats sont broyés pendant 30 secondes dans l’azote liquide à l’aide d’un broyeur à lame rotative (2000 tpm) équipé d'un bol en acier inox. Ce procédé permet d’obtenir une poudre parfaitement homogène qui est conservée à - 20°C jusqu'à la mise en œuvre des analyses.

Détermination de la teneur en matière sèche

La teneur en matière sèche de chaque échantillon de viande et d'abat est déterminée en séchant 1,5g de poudre d’échantillon à l'étuve à 80°C pendant 48 h (Norme AFNOR NF V04-401). Les mesures sont effectuées en double. Les résultats sont exprimés en g/100 g de tissus frais.

Détermination de la teneur en protéines

La teneur en protéines est déterminée par le dosage de l'azote total d’1g d’échantillon selon la méthode Kjeldahl (Norme AFNOR NFV04 407).
Le principe consiste en une minéralisation d’environ 1 g d’échantillon par chauffage en présence de l'acide sulfurique concentré et d'un catalyseur. Après alcalinisation de produits de la réaction, l'ammoniac libéré est distillé et piégé dans une solution d'acide borique. Il est ensuite titré par une solution d'acide sulfurique. Après calcul de la teneur en azote total, la teneur en protéines est calculée selon la formule suivante : % protéine = % azote x 6,25 et x 5,6. Les résultats sont exprimés en g/100 g de tissus frais.

Détermination de la teneur en lipides totaux

Les lipides sont extraits, à température ambiante de 4 g environ d’échantillon par les solvants organiques selon la méthode de Folch et al. (1957). 4 g de poudre d’échantillon sont dispersés dans 45 ml du mélange chloroforme/méthanol (2/1, v/v) à l’aide d’un broyeur tournant à 12.000 tpm. Le broyage est effectué en une séquence de 3 cycles de 1 min espacés chacun d'une minute pour éviter tout réchauffement. L’homogénat est filtré sous vide sur un erlenmeyer surmonté d'un entonnoir muni d'un verre fritté (N° 0). La galette de filtration est récupérée et l’opération est renouvelée deux fois selon le même cycle de broyage. Les trois filtrats sont réunis (# 150 ml) dans une ampoule à décanter et additionnés de 37 ml d'une solution d'eau distillée à 0,73 % de NaCl pour permettre la séparation de la phase chloroformique (contenant les lipides) de la phase méthanol/eau (contenant les impuretés en majorité hydrosolubles). La phase chloroformique est soutirée. Le chloroforme est évaporé sous vide. L’extrait sec est pesé à poids constant. La teneur en lipides totaux est exprimée en g/100 g de tissus frais.

Calcul de la teneur en acides gras des lipides totaux

La quantification des acides gras par introduction d’étalon interne dans les extraits lipidiques totaux suivi d’une chromatographie en phase gazeuse, n’a pas permis d’obtenir une quantification fiable et reproductible des acides gras. Nous avons décidé d’estimer la teneur en acides gras des échantillons par calcul. Ce calcul repose sur les éléments suivants :

• Les lipides totaux sont constitués majoritairement de triglycérides et de phospholipides et, d’un peu de cholestérol.
• Les acides gras constituent 89 % de la masse des triglycérides.
• Les acides gras constituent 60 % de la masse des phospholipides.
• A partir des teneurs en lipides totaux et en phospholipides mesurées dans ce travail, la teneur en triglycérides est calculée par différence (% TG = % LT - % PL).

Le pourcentage des acides des lipides totaux est calculé à partir de la formule suivante :
% AG dans LT = 0,89 x %TG + 0,60 x %PL ou % AG dans LT = 0,89 x %LT - 0,29 x %PL
La quantité d’acides gras de chaque échantillon est calculée en multipliant ce pourcentage par sa teneur en lipides. Elle est exprimée en mg/100 g d’échantillon.

Détermination de la composition des acides gras des lipides totaux

La préparation des esters méthyliques d'AG est effectuée selon la méthode proposée par Sébédio et al, (1997). Elle consiste à saponifier 20-50 mg des lipides dissouts par 100µl de toluène pendant 20 minutes à température ambiante par le méthanolate de sodium 2N (200 µl). Les savons de sodium d'AG sont transformés en esters méthyliques en 20 minutes par ajout dans le milieu de 1 ml de méthanol à 14% de BF3 selon la méthode de Morrison et Smith (1964). Après ajout de 2 ml d'hexane et de 5 ml d'eau saturée de NaHCO3, les tubes sont centrifugés. La phase hexane est recueillie, puis éliminée par évaporation sous azote. Les acides gras sont alors repris dans 150 µl d'hexane et stockés à - 20°C jusqu'à leur analyse par CPG.
L'analyse des esters méthyliques est réalisée par CPG à l'aide du chromatographe PR 2100 (Périchrom, 91160 Saulx-les-Chartreux) équipé d'un passeur/injecteur automatique et d’un détecteur à ionisation de flamme. Le chromatographe est piloté à l'aide du logiciel Winilab III selon la méthode décrite par Scislowski et al (2005). La séparation des AG est réalisée sur une colonne capillaire de type CP-Sil 88 de 100 m de long, 0,25 mm de diamètre interne et 0,20 µm d'épaisseur de phase stationnaire. L’hydrogène utilisé comme gaz vecteur est produit par le générateur Nitrocraft NCH 003. La pression en tête de colonne est de 130 psi. L’injection est effectuée en mode division (30 ml/min). La température de l’injecteur est maintenue à 235°C. La température du détecteur est maintenue à 250°C. La température du four est programmée comme suit : 70°C pendant 30s, puis une montée de 70 à 175°C à 20°C par min, suivi d’un maintien à 175°C pendant 25 min, puis une nouvelle montée de 175 à 215°C à 10°C par min, température maintenue pendant 42 min. La durée totale de l’analyse est de 52 min.
Les acides gras sont identifiés par leur temps de rétention et comparés à ceux d'acides gras standards (mélange Supelco, Sigma). Les résultats sont exprimés en % des acides gras totaux.

Caractérisation de la fraction des acides gras trans

Elle est réalisée suivant la méthode proposée par Juanéda et al. (2002).
A partir des esters méthyliques des lipides préparés précédemment, une solution à 20-25 mg/ml est préparée dans l’acétone. 120 µl sont injectés en HPLC (2 mg). Le système HPLC (Kontron) est équipé d’un passeur automatique d’échantillon et d’un détecteur UV. Il est muni de 2 colonnes de silice greffée C18 de 25 cm de long, 10 mm de diamètre remplies d’une phase de 5 µm de granulométrie. Les acides gras trans sont séparés des acides gras cis en mode isocratique. La phase mobile est composée d’acétonitrile et son débit est fixé à 4 ml/min. L’élution des acides gras trans requiert 40 min. Ils sont parfaitement séparés dans acides gras cis. Ils sont collectés en sortie de colonne et analysés suivant la méthode décrite ci-dessus.
Références : Juanéda et al., 2002, J Chromatogr. A-954, 285-289
Dimisi et al., 2002, Analytica Chemica Acta, 465,395-407

Détermination de la teneur en acides aminés

Les acides aminés sont libérés par hydrolyse dans l’acide chlorhydrique, à 120°C, par la méthode à reflux.
On utilise de l’HCl 5,5 N à la place de l’HCl 6N classiquement utilisé, parce que c’est à cette concentration que le mélange acide se condense à l’altitude de 850 m. L’ajustement à 5,5 N permet ainsi de limiter les pertes d’acide dans l’atmosphère.
Pour la plupart des acides aminés 24 h d’hydrolyse sont suffisantes pour rompre les liaisons peptidiques. Cependant, la valine et l’isoleucine sont très longues à être libérées et nécessitent un temps d’hydrolyse de 48 h. Les acides aminés soufrés (cystéine et méthionine) sont plus ou moins dégradés par l’hydrolyse dans l’acide chlorhydrique, et une oxydation préalable de ces acides aminés est nécessaire pour les protéger lors de l’hydrolyse acide. L’oxydation est réalisée avec un mélange acide formique-eau oxygénée-méthanol. La méthionine est alors libérée sous forme de méthionine sulfone et la cystéine sous forme d’acide cystéique.
Le tryptophane est libéré par hydrolyse dans de la baryte (4N), à 110°C, dans des tubes fermés.
Dans ces conditions 16 h d’hydrolyse sont suffisantes pour rompre les liaisons peptidiques.
Un standard interne, la Norleucine, est ajoutée à l’échantillon avant l’hydrolyse et permet d’évaluer le rendement des opérations de traitement de l’échantillon à doser.
3 hydrolyses différentes sont donc nécessaires pour déterminer la composition complète en acides aminés (à l’exception du tryptophane) :

• une hydrolyse de 24 h,
• une hydrolyse de 48 h pour les acides aminés ramifiés,
• une hydrolyse de 24 h après oxydation performique pour les acides aminés soufrés.

Après chaque type d’hydrolyse, les acides aminés sont séparés par chromatographie sur colonne échangeuse d’ions, et quantifiés après réaction avec la ninhydrine.
Le poids de l’échantillon hydrolysé et sa MS, le poids et la concentration exacte de la solution de norleucine ajoutée, ainsi que le poids d’hydrolysat récupéré après le rinçage des tubes d’hydrolyse, sont utilisés pour calculer les concentrations en acides aminés dans l’échantillon.

Analyse de la teneur en sélénium musculaire

Le contenu en sélénium (Se) du muscle est déterminé par couplage chromatographie en phase gazeuse – spectrométrie de masse (CPG-SM) selon les conditions décrites par Ducros et Favier (1992).
Chaque échantillon ( 0,2 g de muscle), pré-dégradé par l’acide nitrique, est additionné d’une quantité connue d’un standard interne (sélénite de sodium enrichi en Se 76) puis digéré totalement en présence d’un mélange d’acide nitrique et de peroxyde d’hydrogène à l’aide d’un minéralisateur par micro-ondes selon Ducros et al (1994). Après minéralisation, l’ensemble des formes du sélénium sont réduites à l’état de sélénite (Se 4+). L’addition de 4-nitro-O-phenylènediamine en milieu acide permet la formation d’un chélate stable de Se (nitropiazsélénol (Se-NDP)). Après chromatographie du chélate extrait, la détermination en mode SIM de deux ions sélectionnés à m/z 225 et 229 correspondant aux isotopes 76 et 80 du sélénium, permet de calculer la quantité de Se dans l’échantillon après avoir pris en compte l’abondance des contributions naturelles (calcul de dilution isotopique). Pour chaque série, un contrôle de qualité à valeur certifiée est préparé dans les mêmes conditions (Bovine Liver 1577B, NIST).
Références de la méthode :

• V. Ducros, A. Favier. (1992) Gas chromatographic-mass spectrometric method for the determination of selenium in biological samples. Journal of Chromatography, 583 35-44.
• V. Ducros, D. Ruffieux, N. Belin, A. Favier. (1994) Comparison of two digestion methods for the determination of selenium in biological samples. Analyst, 119 1715-1717.

Analyse de la teneur en fer total et zinc

Préparation de la matière sèche à partir de broyat de muscle (protocole xx0) : les échantillons sont placés 48 h à 80°C dans une étuve, puis les galettes formées par dessiccation sont homogénéisées à la spatule ou au broyeur à bille. Les poudres obtenues sont remises à 80°C pendant 24h pour éliminer les traces d'humidité résiduelle avant distribution des échantillons.
Dans un premier temps, les matières sèches sont minéralisées dans un four à moufle à 500°C. Cette étape est appelée "voie sèche", elle permet de réduire les échantillons en cendres. Dans un deuxième temps, elles sont minéralisées sur plaques entre 100 et 120°C alternativement en présence d'acide nitrique et d'eau oxygénée. Cette étape est dite "voie humide", elle permet d'éliminer le carbone résiduel pour obtenir des cendres pures.
Les teneurs en fer et zinc dans les cendres sont analysées par spectrométrie d'absorption atomique (Perkin Elmer AA800).

Détermination de la teneur en fer héminique

A l'aide d'un solvant organique, l'acétone, on extrait le groupement héminique détaché de son support protéique par acidification du milieu à l'acide chlorhydrique. La solution obtenue est filtrée. La libération du groupement héminique induit une coloration de la solution dont l'intensité est mesurée au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 512nm puis comparée à une solution standard de chloro-hémine (Hemin bovin recristalized).

Analyse de la teneur en vitamines du groupe B

Vitamine B3
La Vitamine B3 (acide nicotinique et nicotinamide) est dosée selon la méthode suivante :

• extraction de la vitamine par hydrolyse enzymatique à la NADase,
• dosage par HPLC avec une détection fluorimétrique après dérivation post-colonne par irradiation UV (LQ =0,2 mg/100g).

Vitamine B6
La Vitamine B6 (pyridoxamine-pyridoxal-pyridoxol) est dosée selon la méthode de référence XP ENV 14164 dont le principe est le suivant : extraction de la vitamine par hydrolyse acide suivie d'une déphosphorylation à la phosphatase acide puis transformation du pyridoxamine en pyridoxal par réaction avec l'acide glyoxylique.
La réduction en pyridoxol est réalisée par le borohydrure. Le dosage de la vitamine B6 est réalisé par HPLC avec détection en fluorimétrie (LQ =0,05 mg/100g).

Vitamine B12
Chaque échantillon est analysé pour sa teneur en vitamine B12 "vraie", correspondant à la forme biologiquement active. Après homogénéisation des échantillons dans un tampon acétate (0,1 M, pH 4.6) suivie d'une hydrolyse avec de la papaïne (100 mg/ml) et d'une cyanisation en présence d'un excès de cyanure de sodium (1 %) à 60°C pendant 1 h, la teneur en vitamine B12 vraie des échantillons tissulaires sont déterminées par méthode radio-isotopique avec le kit Quantaphase ® B 12 de Bio-Rad (USA), en utilisant le Facteur Intrinsèque comme accepteur de vitamine B12.
La valeur en vitamine B12 est exprimée par unité de matière "fraîche" (ng de vitamine B12 par g de tissus frais). En raison du caractère hydrophile de la Vit B12 et de sa liaison aux protéines (Mellman et al. 1977 ; Kolhouse et Allen, 1977), ces teneurs seront aussi exprimées par rapport à la Matière Sèche (MS), (ng de vitamine B12 par g de Matière Sèche), et en fonction de la matière sèche délipidée représentative de la fraction protéique de la viande (en ng de vitamine B12 par g de matière sèche délipidée).

Analyse de la teneur en vitamine A (« rétinol total »)

Réalisation de la reconstitution puis de la prise d’essai d’un « homogénat de foie » auquel on ajoute un étalon interne pour déterminer sa teneur dans l'homogénat. La vitamine A est extraite par l'hexane. Les phases hexaniques sont éliminées par évaporation et l’extrait sec est resolubilisé par le mélange méthanol + dichlorométhane en vue de son analyse par HPLC.
La vitamine A est séparée par HPLC sur chaîne Waters équipée d’un injecteur automatique thermostaté et détectée par spectrophotométrie avec un détecteur UV à barette de diodes pilotée par micro-informatique (logiciel Millenium). La colonne est de type C18 avec un élution de type isocratique (phase mobile : méthanol). La vitamine est dosée à 325 nm
L’identification des pics s’effectue par le temps de rétention par comparaison avec une gamme d’étalonnage externe. La quantification s’effectue par intégration (en surface) des pics et comparaison avec la gamme d’étalonnage externe et après prise en compte du rendement de l’extraction évalué à l’aide de l’étalon interne.